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藤黃酸誘導人結腸癌細胞凋亡研究

 論文欄目:癌細胞論文     更新時間:2020/4/3 15:41:06   

[摘要]目的:探討藤黃酸對不同發生途徑的人結直腸癌細胞凋亡的影響。方法:采用AnnexinV-FITC/PI雙染法,檢測藤黃酸給藥后對HCT116及SW480細胞凋亡的影響。結果:0.25、0.5、1.0μg/mL濃度的藤黃酸對HCT116細胞的總凋亡率分別為25.98%、31.08%、37.94%,各濃度的藤黃酸對HCT116細胞的總凋亡率與空白對照組相比,差異有統計學意義(P<0.05),并且呈濃度依賴性;0.25、0.5、1.0μg/mL濃度的藤黃酸對SW480細胞的總凋亡率分別為8.36%、35.05%、38.93%,各濃度的藤黃酸對SW480細胞的總凋亡率與空白對照組相比,差異有統計學意義(P<0.05),并且呈濃度依賴性。結論:藤黃酸對人結腸癌細胞有較好的促凋亡作用。

[關鍵詞]結直腸癌;HCT116;SW480;細胞凋亡;腫瘤;藤黃酸

結直腸癌是嚴重威脅人類健康,具有較高致死率的惡性腫瘤。近年來,其發病率呈現逐年升高的趨勢[1-2]。近年來中醫藥在治療惡性腫瘤等難治性疾病方面越來越受到人們的關注[3-4]。中藥藤黃具有殺蟲攻毒、消腫斂瘡的功效,常用于治療潰瘍濕瘡、跌打腫痛、癰疽腫毒等。前期研究發現[6-7],藤黃提取物藤黃酸能夠顯著抑制結直腸癌腫瘤細胞的增殖,誘導細胞周期阻滯,促使結腸腫瘤凋亡[8-12]。本研究通過觀察體外實驗藤黃酸對不同發生途徑的人結腸癌細胞株的影響,探討其作用機制。

1材料與方法

1.1實驗藥物藤黃酸由南京源端生物科技公司提供,經南京中醫藥大學藥學院鑒定。1.2細胞培養人結腸癌細胞HCT116和SW480(美國ATCC公司)。將HCT116和SW480細胞培養于RPMI-1640培養基中,該培養液中還應包含10%胎牛血清,青霉素及鏈霉素各100U/mL。將細胞置于37℃、5%CO2,有一定濕度的恒溫箱中進行培養。每2~3d進行一次傳代,待細胞處于對數生長期時進行實驗。1.3試劑RPMI-1640培養基(美國GIBCO公司);胎牛血清(FBS,美國GIBCO公司);AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(凱基生物公司);胰蛋白酶消化液及磷酸鹽緩沖液(PBS,南京源端生物公司);PI染料(北京雷根生物公司)。1.4儀器流式細胞儀(Becton-DickinsonBD公司);CO2培養箱(美國ThermoFisherScien-tific公司);低速離心機(德國Eppendorf公司);倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。1.5實驗方法采用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡情況。將HCT116、SW480細胞置于37℃、5%CO2環境中進行培養,傳代培養至對數生長期,將該期細胞消化計數,以5×104個/孔的密度將細胞鋪入6孔板中。待細胞貼壁變形后,加藥處理,空白對照組不給予藥物干預;其他組藥物干預48小時后,用無乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化收集細胞于各流式管中,PBS洗滌3遍;用離心機轉速1000rpm,離心5分鐘后收集細胞,棄除上清,每管加入500μL連接緩沖液(BindingBuffer)重懸細胞;往各管加入5μLAnnexinV-FITC染料混勻,再加入5μLPI染料混勻,室溫環境下避光反應20分鐘;運用流式細胞儀檢測,觀察細胞凋亡情況。見表1。1.6統計學方法采用SPSS16.0處理相關數據,計量資料用(χ±s)表示,多組間的比較使用單因素方差分析(ANOVA),組間比較使用t檢驗,P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1藤黃酸對HCT116細胞凋亡的影響濃度為0.25、0.5、1.0μg/mL的藤黃酸對HCT116細胞的早期凋亡率分別為11.02%、13.68%、13.62%,晚期凋亡率分別為14.96%、17.4%、24.32%,總凋亡率分別為25.98%、31.08%、37.94%,呈濃度依賴性。各濃度藤黃酸對HCT116細胞的總凋亡率與空白對照組相比,差異有統計學意義(P<0.05),并且呈濃度依賴性。見圖1—2。2.2藤黃酸對SW480細胞凋亡的影響濃度為0.25、0.5、1.0μg/mL的藤黃酸對SW480細胞的早期凋亡率分別為4.62%、14.82%、16.21%,晚期凋亡率分別為3.74%、20.23%、22.72%,總凋亡率分別為8.36%、35.05%、38.93%,呈濃度依賴性。各濃度藤黃酸對SW480細胞的總凋亡率與對照組相比,差異具有統計學意義(P<0.05),并且呈濃度依賴性。見圖3—4。

3討論

近年來,我國結直腸癌的發病率呈現出逐年升高的趨勢[7]。目前,該病的治療主要依靠手術切除,并配合放、化療和其他輔助治療。中醫藥在診治腫瘤等惡性疾病方面發揮著巨大作用,不僅可以改善患者的臨床癥狀,提高生活質量,還可以降低腫瘤轉移率和術后復發率。有報道[13]顯示,藤黃可以通過干預腫瘤細胞的多種生物學行為,產生強烈的抗腫瘤作用。腫瘤的發生、發展與多種機制相關,其與腫瘤細胞的無限增殖和侵襲密切相關。目前,誘導腫瘤細胞凋亡已經成為治療結直腸腫瘤的重要目標。為了明確藤黃的有效成分藤黃酸對結直腸腫瘤細胞是否有促凋亡作用,我們進行了本實驗研究。在本研究中,我們采用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測不同濃度藤黃酸干預的HCT116及SW480細胞。結果發現,各濃度的藤黃酸對不同發生途徑的人結直腸癌細胞均有促凋亡作用,與空白對照組相比,差異有統計學意義(P<0.05),且呈濃度依賴性。綜上所述,藤黃酸可有效誘導結直腸腫瘤細胞凋亡,影響腫瘤細胞的生物學行為,進而抑制其生長。

作者:王微 李悠然 陳邑歧 吳旻娜 韓笑 谷云飛 單位:南京中醫藥大學 南京中醫藥大學附屬江蘇省中醫院

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